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通过Morris水迷宫实验在大鼠体外循环导致的术后认知功能障碍中的作用

日期:2020-03-30 19:32
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摘要:目的:通过建立老年大鼠体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB) 导致的术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunctions,POCD) 模型,初步探讨老年大鼠CPB后POCD及海马神经元凋亡与神经调节 素受体降解蛋白(Nrdpl)的相关性。通过慢病毒构建空载质粒、Nrdpl 过表达及沉默海马神经元细胞,探讨Nrdpl在缺氧复氧模型中对神经 元细胞凋亡的调控作用;并通过基因干扰大鼠海马Nrdpl的表达,在 载体水平探讨Nrdpl对老年大鼠CPB后POCD的影响及其发挥作用的 调控机制是否与Nrdpl泛素化降解底物蛋白ErbB3及下游AKT信号通 路,促进神经元凋亡有关。

神经调节素受体降解蛋白(Nrdpl)在老年大鼠体外循环导致的术后认知功能障碍中的作用及机制研究

摘要

目的:通过建立老年大鼠体外循环(cardiopulmonary bypassCPB导致的术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunctionsPOCD)

模型,初步探讨老年大鼠CPBPOCD及海马神经元凋亡与神经调节 素受体降解蛋白(Nrdpl)的相关性。通过慢病毒构建空载质粒Nrdpl 过表达及沉默海马神经元细胞,探讨Nrdpl在缺氧复氧模型中对神经 元细胞凋亡的调控作用;并通过基因干扰大鼠海马Nrdpl的表达,在 载体水平探讨Nrdpl对老年大鼠CPBPOCD的影响及其发挥作用的 调控机制是否与Nrdpl泛素化降解底物蛋白ErbB3及下游AKT信号通 路,促进神经元凋亡有关。

方法:

第1部分

选取18月龄SD (Sprague-DawleySD)雄性大鼠60只,按照随 机数字表法分为三组n=20),即对照组C组)、假手术组S组)、 模型组M组)。建模前对老年大鼠进行为期5天的行为学基线测试及 Morris水迷宫训练。C组做为空白对照组,S组大鼠只做对应的血管结 扎,而未进行CPBM组为CPB组。通过Morris水迷宫实验观察三 组老年大鼠术后第1、3、7天行为学的改变,包括1.定位巡航实验(测

量逃逸潜伏期和游泳速度)、2.空间探索实验(测量停留时间百分比和 停留路程百分比),以评价CPB对学习、记忆功能的影响。造模结束 后,通过使用酶联免yi附法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测CSM三组大鼠在CPB后第1、3、7天海马组织中炎 因子TNF-aIL-lp的含量。用Westem-blot实验方法检测CSM三 组大鼠CPB后海马组织中NrdplErbB3、p-AKTC.Caspase3的表达 水平。通过 TUNEL 染色法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelingTUNEL),分别观察 CS、M 三组大鼠海马 CA1、 CA3、DG区的神经元凋亡情况,并计算其凋亡指数。

第二部分

体外培养海马原代神经元细胞,采用重组克隆技术,在细胞培养 的第5天将慢病毒转染到培养所得的海马原代神经元,构建特异性 Nrdpl过表达组、特异性Nrdpl沉默组以及空载质粒组海马神经元。慢 病毒转染72小时后构建细胞缺氧复氧模型,将海马原代神经元按照随 机数字表法分为5组:空白对照组C组)、缺氧复氧组H/R组)、空 载质粒缺氧复氧组(H/R+NC)、Nrdpl过表达缺氧复氧组(H/R+Nrdpl )、Nrdpl 沉默缺氧复氧组(H/R+shNrdpl )〇Westernblot检测Nrdpl、 ErbB3、p-AKTAKTC.Caspase3蛋白的变化情况。采用MTT法检 测神经元的活性。流式细胞仪检测神经元的凋亡情况。

第三部分

选取18月龄SD雄性大鼠60只。15只大鼠进行预实验,通过颅 脑定位仪将慢病注射大鼠海马CA1区,构建空载质粒Nrdpl 过表达及沉默大鼠。剩余45只大鼠实施CPB手术,随机分为5 n=9):空白对照组C组)、体外循环组M组)、空载质粒体外 循环组M+NC组)、Nrdpl过表达体外循环组M+Nrdpl)、Nrdpl 沉默体外循环组M+shNrdpl组)。通过Morris水迷宫实验观察五组老 年大鼠术后行为学的改变,包括1.定位巡航实验、2.空间探索实验,以 评价CPB对学习、记忆功能的影响。TUNEL荧光染色,观察各组大 鼠海马CA1区的海马神经元凋亡情况Western blot实验方法检测五组 大鼠在 CPB 后海马组织中 NrdplErbB3、p-AKT、AKT 和 C.Caspase蛋白的变化情况。


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