2023年11月12日中国农业科学院植物保护研究所刘欣刚研究团队在Science of the Total Environment杂志发表了“Imidacloprid affects the visual behavior of Mature zebrafish by mediating the expression of opsin and phototransduction genes and altering the metabolism of neurotransmitters”，揭示了吡虫啉通过介导视蛋白和光转导基因的表达，改变神经递质的代谢，从而影响成年斑马鱼的视觉行为。
吡虫啉是硝基亚甲基类内吸杀虫剂，是烟碱乙酰胆碱受体的作用体，干扰害虫运动神经系统使化学信号传递失灵，吡虫啉对水生生态系统构成重大威胁。本研究探讨了吡虫啉对成年斑马鱼的视觉毒性及其分子机制。视动反应是指斑马鱼对移动的目标有一种追逐的行为，该反应可以用来检测幼鱼和成鱼的视觉相关基因突变。视动反应(OKR)和视运动反应(OMR)测试是经典的用于检测斑马鱼视觉功能异常的行为测试（OKR/OMR设备和分析软件购自上海欣软）。利用该设备在环境相关浓度暴露吡虫啉21天后，检测发现成年斑马鱼的视觉行为受损，Immunofluorescence Experiment表明，斑马鱼视网膜中视紫红质的含量发生了明显的变化。在成年斑马鱼中，基因表达节律在暗和亮光捕获中起关键作用，以及光转导的24小时被显著破坏。靶向代谢组学分析显示，与神经递质功能相关的16种代谢物的含量发生了显著变化，并在精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、色氨酸代谢等前三种代谢途径中富集。这些结果表明，环境相关浓度的吡虫啉暴露可通过干扰视蛋白的表达，影响斑马鱼成虫视网膜中的光转导而引起光毒性。
测试装置为透明圆柱形鱼缸，直径为7 厘米，高7厘米，直径8.5厘米的滚轮放置在鱼缸周围有光栅条（12个周期的黑白条纹）。外部光系统由两个圆形光管组成，直径为21厘米，调节亮度。实验视频是在带摄像头的显微镜（OLYMPUS SZX10，日本），可捕获并记录实时运动。所有OKR和OMR测试均已通常在10:00至16:00之间进行。OKR/OMR设备和分析软件对从眼球追踪设备收集的数据进行分析以确定顺时针和逆时针方向的网格刺激对眼球运动的影响。OMR测试中可检测运动距离（m）、运动速度（m/s）、PPR时间（s）、PNR时间（s）和僵直时间（s）等。
与对照组相比，暴露于吡虫啉浓度10 μg/L 21天，成年斑马鱼右眼受到顺时针刺激时，慢相时间和反射增益均显著减少，扫视运动频率增加当改为逆时针刺激时，暴露于10 μg/L吡虫啉的成年斑马鱼右眼和左眼的慢相位时间以及反射增益均显著减少。与对照组相比，用10 μg/L浓度的吡虫啉处理后各组左右眼的眼跳运动频率明显增强。然而，浓度为1和100 μg/L的吡虫啉的斑马鱼的参数没有显著变化。这些结果表明，浓度为10 μg/L的吡虫啉暴露影响了斑马鱼对视觉刺激的平稳跟踪和准确、有效的快速眼球运动的能力，这可能会影响斑马鱼的运动协调。
成年斑马鱼在接受顺时针和逆时针网格刺激时，行走距离和速度显著下降，10 μg/L和100 μg/L处理组斑马鱼的冻结时间显著增加。此外，与对照组相比，10 μg/L吡虫啉处理的成年斑马鱼在刺激方向的游泳时间显著减少。这些结果表明，吡虫啉暴露对成年斑马鱼的视觉系统处理和视觉引导下的自我运动的能力有负面影响，证实了OKR试验的结果。
作者接下来进行组织病理学分析，以确定视网膜切片是否发生了形态学改变，视网膜层是否受到特异性影响。对照组和用药组形态完整，形状规则，由神经节细胞、内丛状、内核、外丛状、外核层、光感受器和色素细胞组成。Immunofluorescence Experiment使用特异性抗体标记视网膜中相应的标记物。结果显示，Sox2（Sry-box 2，视网膜祖细胞标记物）和Islet1（ISL1基因，神经节细胞和神经节细胞标记物）的阳性细胞密度或阳性细胞百分比均无显著差异。然而，与对照组相比，成年斑马鱼视网膜在10 μg/L后的阳性细胞密度和阳性细胞的百分比显著降低。用药组中视网膜色素上皮中的一种蛋白质Rpe65（类视黄醇异构水解酶65）的百分比显著高于对照组。
10 μg/L的吡虫啉暴露显著改变了4个视蛋白基因的表达节律，即opn1mw3、opn1lw2、opn1sw2和rho、一个转导基因gnb3b和一个抑制蛋白基因arr3a与视网膜中的光转导有关。此外，与视黄醇代谢相关的基因rpe65a的相对表达量也发生了显著变化。然而，相对表达水平在24h期间的非视觉视蛋白基因opn3和opn4b，和sox2，胰岛1和hcrt没有显著改变。
通过靶向代谢组学分析，研究了成年斑马鱼中吡虫啉暴露后参与神经递质功能的39种代谢物的改变。如图显示了吡虫啉处理组与对照组的39种代谢物含量的热图。吡虫啉暴露后，斑马鱼大脑中16种代谢物水平发生显著变化，其中11种代谢物升高。KEGG通路分析显示，有10条通路显著富集，其中9条通路参与代谢，1条与遗传信息处理相关。前三的代谢途径是精氨酸生物合成；丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢和色氨酸代谢。网络分析可以直观地探索为一个交互式网络，其节点（代谢物）大小对应于节点度和基于两个连接节点之间的相关性的边缘厚度。六种富含丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢的代谢物和五种富含色氨酸代谢的代谢物主要通过L-谷氨酸相互作用和影响。
一些研究报告称，吡虫啉暴露在高剂量或亚致死剂量下诱发昆虫视觉功能障碍。在本研究中，将成年斑马鱼暴露于环境相关浓度的吡虫啉中21天，结果表明，吡虫啉暴露通过破坏视蛋白和光传导级联相关基因的表达节律，导致斑马鱼的视觉行为异常，导致色氨酸代谢失衡谷氨酸系统与光敏功能和视觉处理有关。作者的研究证实了新烟碱类杀虫剂所造成的视觉毒性风险。此外，研究结果可能为昼夜节律和视网膜功能之间的相互作用提供证据。
- 上海欣软，咨询：400-833-6811 / 13262879783
- 如果您也对动物实验感兴趣，欢迎关注和推荐关注知乎帐号：知鼠达理和微信公众号：BrainTalks, 脑声常谈，专注于动物神经科学与行为学的实验知识的方法传播与分享交流，您可以推荐给您身边的朋友、同学以及老师，我们会定期更新您需要的相关实验方法的视频和文章，希望能对大家带来帮助！对实验设备有兴趣的小伙伴可以联系知鼠达理の刘工13262879783
