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观察温肾健脾法对腹泻型肠易激综合征大鼠内脏敏感性及旷场实验的影响

日期:2019-12-06 12:07
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摘要:目的 观察温肾健脾法对腹泻型肠易激综合征( IBS) 模型大鼠内脏敏感性及旷场实验的影响。方法 28 只乳鼠随机分为正常组、模型组、温肾健脾方组、匹维溴铵组 4 组,每组 7 只。模型组、温肾健脾方组及匹维溴铵组乳鼠自出生第 2 天 ~ 第 21 天每天与母鼠分离 3 h,正常组不予干预。第 22 天断奶,予常规自由饮食。第30 天起模型组、肾健脾方组及匹维溴铵组予以番泻叶水煎液灌胃,同时温肾健脾方组和匹维溴铵组分别以温肾健脾方溶液和匹维溴铵片混悬液灌胃。正常组、模型组以相同剂量生理盐水灌胃,连续 4 周。观察各组大鼠腹壁撤退反射评分( AWR 评分) 及旷场试验结果。

温肾健脾法对腹泻型肠易激综合征大鼠内脏敏感性和旷场实验的影响

【摘要】 目的 观察温肾健脾法对腹泻型肠易激综合征( IBS) 模型大鼠内脏敏感性及旷场实验的影响。方法 28 只乳鼠随机分为正常组、模型组、温肾健脾方组、匹维溴铵组 4 组,每组 7 只。模型组、温肾健脾方组及匹维溴铵组乳鼠自出生第 2 天 ~ 第 21 天每天与母鼠分离 3 h,正常组不予干预。第 22 天断奶,予常规自由饮食。第30 天起模型组、肾健脾方组及匹维溴铵组予以番泻叶水煎液灌胃,同时温肾健脾方组和匹维溴铵组分别以温肾健脾方溶液和匹维溴铵片混悬液灌胃。正常组、模型组以相同剂量生理盐水灌胃,连续 4 周。观察各组大鼠腹壁撤退反射评分( AWR 评分) 及旷场试验结果。结果 温肾健脾方和匹维溴铵zhi疗可以显著降低腹泻型肠易激综合征模型大鼠 AWR 评分,缓解其内脏敏感性,显著缓解大鼠精神萎靡,提高其活跃性。结论 温肾健脾方可有效改善腹泻型肠易激综合征模型大鼠的内脏敏感性及焦虑抑郁样行为。

 

肠易激综合征( Irritable bowel syndrome,IBS) 是临床上常见的一种功能性肠道ji病,常以fu痛、腹

泻、便mi等为主要临床表现[1 - 2]。我国发病率约为1% ~ 16%[3]。腹泻型肠易激综合征 ( Diarrhea -predominant irritable bowel syndrome,IBS - D) 是 IBS zui常见的亚型,占 IBS 23. 3% ~ 65. 0%[4],以反复腹泻、fu痛发作为主要临床表现,常伴焦虑、抑郁等精神心理异常[5]。研究发现,IBS 发病多与胃肠道动力异常以及内脏感觉高敏感性有关[6]。魏玮教授临床用温肾健脾法zhi疗 IBS - D 患者临床疗效甚佳[7],本实验通过观察温肾健脾法对 IBS - D 大鼠内脏敏感性及旷场实验的影响,探索温肾健脾法zhi疗 IBS - D 的疗效和作用机制,为温肾健脾法在临床的推广应用提供实验依据。

1 材料与方法

1. 1 实验材料

1. 1. 1 实验动物 28 只 SD 大鼠乳鼠及 SD 大鼠母鼠购自湖北省实验动物研究中心。等级: SPF 级,动物批号: 42000600023620,实验动物使用许可证号:SYXK( 鄂) 2013 - 0069。

1. 1. 2 实验药wu番泻叶,药wu购于中国中医科学院望京医院; 温肾健脾方由肉豆蔻 15 g,补骨脂 30g,五味子 9 g,吴茱萸 9 g,党参 30 g,白术 15 g,郁金18 g,生姜 10 g,大枣 10 g 组成 。药wu购于中国中医科学院望京医院。匹维溴铵,购于北京万生药业有限责任公司,国药准字 H20133036。

1. 1. 3 试剂与仪器 球囊导管 ; 旷场实验箱: 上海欣软( XR -XZ301) ; YP402N 电子天平 ; AHB - 2 - LB 万能照相机 。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 分组与给药 参照课题组前期造模方法造模 [8]。28 只刚出生乳鼠随机分为 4 组,每组 7 只,并与 1 只母鼠同笼饲养。模型组( Model 组) 、温肾健脾方组( WSJP 组) 及匹维溴铵组( Pinaverium bromide 组) 乳鼠于出生后第 2 天 ~ 第 21 天每天上午9: 00 - 12: 00 与母鼠分离 3 h,正常组( Normal 组) 不予干预。第 22 天断奶,予常规自由饮食。第 30 天起模型组、温肾健脾方组及匹维溴铵组以 1. 0 g /ml番泻叶水煎液灌胃( 10 ml / kg) ,1 次/ d。同时温肾健脾 方 组 将 中 药 定 量 加 水 400 ml,煎 煮 浓 缩 至200 ml,按 10 ml / kg 灌胃给药,2 次/ d( 大鼠用药剂量= 人体用药剂量 × KB/KA,KB = 0. 71,KA = 0. 11) 。匹维 溴 铵 片 碾 碎 后 溶 于 蒸 馏 水 配 制 成 浓 度 为1. 5 mg /ml混悬液,按15 mg /( kg·d) 剂量灌胃给药,2 次/ d( 即匹维溴铵组灌胃剂量为30 mg/( kg·d) 。正常组、模型组以相同体积生理盐水灌胃,连续 4 周。

1. 2. 2 观察指标

1. 2. 2. 1 一般情况 观察大鼠的精神状态、体质量、活动情况、毛发光泽度、食欲、大便性状等。

1. 2. 2. 2 腹壁撤退反射 造模后大鼠在实验前24 h禁食不禁水,轻触其肛men部位使其排尽大便。

在大鼠轻度麻醉状态下从肛men缓慢插入未充气且涂石蜡油的后带球囊的导管,球囊末端距肛men约1 cm,在肛men外1 cm 处将其固定在大鼠尾根部。每只大鼠给予球囊扩张 3 次,容量分别为 1. 0、1. 5、2. 0 ml,每次扩张持续 30 s。每次 4 min,每只重复 3 次,每组 7 只大鼠 AWR 评分( 表 1) 取平均值进行统计分析。

 

1. 2. 2. 3 旷场实验 旷场实验( 上海欣软 XR -XZ301) 所用实验箱为高 30 ~ 40 cm,底边长为 100

cm 的旷场,周壁的颜色为黑色,旷场底面被平均分为 25 个 4 cm × 4 cm 的小方格。正上方架摄像头,

视野覆盖整个旷场。将大鼠放置在正中央格,同时进行摄像和计时,时间为 5 min。通过计算机示踪分

析系统来分析大鼠在一定时间内的活动状态。实验室要保持安静,室温为 20 ℃ 左右,光线充足。观

察指标: 方格间穿行次数( 动物的四肢从一个格进入另一个格为穿行一次) 、直立次数( 动物双前肢同

时离地,或者双前肢放在墙壁尚算作直立一次) 、中央格停留时间、穿越中央格的次数。

1. 3 统计学方法

采用 SPSS16. 0 统计软件进行数据分析,所有数据以均值 ± 标准差( x ± s) 表示,不同组间两两比较

采用单因素方差分析( One - way ANOVA) 中 LSD 法( zui小显著性法) ,P < 0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 各组大鼠一般状态观察

正常组: 大鼠精神状态良好,活动性积极,粪便呈颗粒状。毛发色白、光泽度良好。进食及饮水量

正常。模型组: 大鼠精神状态萎靡,活动积极性明显减弱,出现困乏状态。粪便稀薄不成形。毛发色

泽略微发黄,缺少光泽度。饮水量增加而进食量减少。温肾健脾方组: 大鼠精神状态有一定程度的恢

复,活动积极性提高。粪便在zhi疗 1 周结束后由稀薄不成形转为半干型及颗粒状。毛发光泽度和进

食量有所提高。匹维溴铵组: 大鼠精神状态有一定程度的恢复,困乏现象基本消失,活动积极性提高。

粪便在zhi疗 5 天后逐渐转为半干型及颗粒状。毛发光泽度和进食量有所提高。

2. 2 大鼠体质量变化监测

随着时间延长,各组大鼠体质量都有一定程度的增加。在同一时间点,模型组相较于正常组的体

质量显著降低; 匹维溴铵组和温肾健脾方组与模型组比较,大鼠体质量显著增加; 匹维溴铵组与温肾健脾

方组体质量比较差异无统计学意义。结果见图 1。

图 1 各组大鼠体质量变化

2. 2 腹壁撤退反射( AWR 评分)

在扩张体积为 1. 0 ml 时,与正常组比较,模型组 AWR 评分显著升高( P < 0. 01) ; 与模型组比较,

匹维溴铵组 AWR 评分显著降低( P < 0. 01) ; 与模型组比较,温肾健脾方组 AWR 评分有所降低,但差异无统计学意义。在扩张体积为 1. 5 ml 和 2. 0 ml 时,与正常组比较,模型组 AWR 评分显著升高( P <0. 01) ,与模型组比较,匹维溴铵组和温肾健脾方组AWR 评分显著降低( P < 0. 01) 。结果见图 2。

2. 3 旷场实验

与正常组比较,模型组大鼠直立次数、方格间穿行次数、穿越中央格次数、中央格停留时间均显著降低( P < 0. 01) 。与模型组相比,温肾健脾方组与匹维溴铵组直立次数、方格间穿行次数、穿越中央格次数、中央格停留时间显著升高( P < 0. 01) 。匹维溴铵组与温肾健脾方组直立次数、方格间穿行次数、穿越中央格次数、中央格停留时间比较差异无统计学意义。结果见表 2 和图 3。

3 讨 论

IBS - D 的病因复杂,发病机制尚未完全阐明,大量的研究表明早期bu良生活事件和精神ji病与IBS 的发病关系密切[9 - 10]。本研究造模方法以团队前期研究的造模方法为基础,予番泻叶灌胃联合母婴分离,即采用物理化学刺激共同作用的方法制备内脏高敏并脾肾阳虚型 IBS - D 大鼠模型[8,11 - 12]。魏玮教授的温肾健脾方是在四神丸基础上加入党参、白术、郁金组成,功效为温补脾肾、涩肠止泻。前期研究显示,该方可有效改善 IBS - D 大鼠腹泻、倦怠蜷卧、饮食减少、体重下降等一般状况[13],提示其可用于脾肾阳虚型 IBS - D 大鼠模型的药wu反证。目前评价内脏高敏模型是否成功的方法主要有腹外斜肌放电和腹壁撤退反射评分。因腹外斜肌放电实验属于有创性操作,增加实验复杂度,因此腹壁撤退反射评分在动物实验中的应用更为广泛。腹壁撤退反射评分,是通过观察受刺激后大鼠的腹肌收缩强度给出评分。本研究采用腹壁撤退反射评分,结果显示模型组较正常组 AWR 评分显著升高,说明模型组大鼠存在内脏高敏感。而温肾健脾方和匹维溴铵zhi疗可以显著降低 AWR 评分,能够缓解 IBS - D 大鼠的内脏敏感性。

旷场实验( OFT) 又称敞箱实验,是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。在大鼠进入新环境后,会经历紧张、兴奋、探索、适应等心理过程,其活动表现为趋避性,好奇性及探索性的特点[14],因而 OFT 能够反映大鼠进入空旷区域时的自我情绪,是评价啮齿类实验动物运动功能和焦虑状态的经典方法。本研究显示,模型组大鼠与正常组相比,直立次数、方格间穿行次数、穿越中央格次数、中央格停留时间均显著降低,说明模型大鼠对新鲜事物的好奇程度降低,精神萎靡,活跃性降低,符合焦虑抑郁样行为。与模型组相比,温肾健脾方组与匹维溴铵组直立次数、方格间穿行次数、穿越中央格次数、中央格停留时间显著升高。匹维溴铵组与温肾健脾方组直立次数、方格间穿行次数、穿越中央格次数、中央格停留时间比较差异无统计学意义,说明温肾健脾方和匹维溴铵具有一定的抗焦虑的作用。

IBS - D 属中医“fu痛”“泄泻”“郁证”等范畴,其发病与感受外邪、饮食不节、情志失调及脏腑虚弱等有关。魏玮教授认为 IBS - D 病位在肠,主要涉及脾、肾、心、肝等,脾肾阳虚是其主要病机,zhi疗应以温肾健脾为主,创立了四神丸加减化裁而成的温肾健脾方( 肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、党参、白术、郁金、生姜、大枣等) ,方中补骨脂辛苦性热而补命门,为壮火益土之要药; 肉豆蔻温补脾肾而涩肠止泻; 吴茱萸暖脾胃而散寒除湿; 五味子性温而不热不燥,温肾固涩; 党参甘温补中,补气升阳,长于止泻; 白术甘温性缓、阳中之阴,可升可降,长于补脾yi气、燥湿利水; 郁金入心治血、体清气窜,其先上行而微下达,长于行qi解郁、祛瘀止痛。生姜散寒行水、大枣滋养脾胃,共为佐药。诸药相合,则温肾暖脾,清心解郁,复运化而固大肠。临床应用收效明显,团队前期开展的研究证实温肾健脾方在免yi、炎症调控[15 - 16]等方面均有一定作用。本研究通过腹壁撤退反射、旷场实验进一步证实温肾健脾方可有效改善肠易激综合征模型大鼠的内脏敏感性及焦虑抑郁样行为,有关具体作用机制仍需要作进一步的探索。

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