1 材料和方法

1.1 动物 50 只健康C57BL/6J雄性小鼠，SPF级，10～12 周龄，体质量23～26 g。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证：SCXK（沪）2012-0002。适应性饲养1周，温度21～25 ℃，湿度50%～60%，光照12 h，期间正常饮水、摄食。

1.2 主要试剂和仪器 丁香精油，纯度100%，原料产地为法国，购自广东揭阳光合生物科技有限公司。精油，纯度100%，原料产地为印度，购自广东揭阳光合生物科技有限公司。TRNzol A+总RNA提取试剂、FastQuant RT Kit（With gDNase）购于北京天根生化有限公司；ssoFast荧光定量试剂购于美国Bio-Rad公司；小鼠血清5-HT ELISA试剂盒购于南京建成生物工程研究所。冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5424R）；普通梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号：T100TM Thermal Cycler）；医用压缩式雾化器（陕西民起电子科技有限公司，型号：MQB-13）；悬尾实验观察箱（上海欣软信息科技有限公司，型号：XR-XX203）；强迫游泳玻璃缸（上海欣软信息科技有限公司，型号：XR-XQ202）。

1.3动物建模、分组及干预**

1.3.1 小鼠抑郁模型建立：50 只C57BL/6J小鼠经体质量、悬尾测试实验（tail suspension test，TST）、强迫游泳实验（forced swim test，FST）及血清5-HT浓度测定初筛后选取各指标相近的45只小鼠。随机从中挑取8 只小鼠作为正常组，剩下的37只小鼠采用慢性不可预知轻度应激模型（chronicunpredictable mild stress，CUMS）和孤养（单鼠单笼饲养）的建模方法[5]，连续应激28 d使其抑郁。应激包括24 h禁食禁水，冷水游泳（12 ℃，5 min），倾斜鼠笼（45°倾，8 h），摇鼠笼（1次/s，5 min），夹尾60 s，潮湿笼子8 h，热水游泳（37 ℃，5 min），夜间照明12 h，夹尾90 s。以上9种刺激每天随机给予1种，隔天刺激不重复，平均每种刺激3次，第18天不予刺激。造模成功的标准：经过28 d的刺激后，与正常和造模前小鼠相比，小鼠TST和FST不动时间百分比应显著延长，体质量显著降低或无明显差异，血清5-HT浓度显著下降。

1.3.2 分组和**方法：从抑郁症造模成功的小鼠中筛选出32 只小鼠并随机分为4 组。丁香组和莉组：分别采用丁香精油和莉精油进行雾化**，分别取50 μL精油和60 mL常温蒸馏水混匀后，加入雾化机中。蒸馏水组：采用蒸馏水进行雾化**，取60 mL常温蒸馏水加入雾化机。将雾化机的喷雾口接入小鼠饲养笼内，打开雾化机，让小鼠持续吸入1 h，每天3 次，持续28 d，期间正常饮水、摄食。抑郁组：和正常组一样，不予任何**措施，正常饲养。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 TST：将小鼠远端尾部约1.5 cm固定后，头向下悬挂，距离地面约35 cm。记录时间总长为360 s，测定指标为悬挂时静止不动的时间百分比，以此反映小鼠无助程度。

SuperTst悬尾实验分析软件：http://www.softmaze.com/s02/product/2014/06/17/20368117.html

1.4.2 FST：将小鼠放入直径为25 cm，高30 cm的透明玻璃水缸里，内注有15 cm高的水，水温为21～25 ℃，总记录时间为360 s，记录的数据为120～360 s时间内，小鼠漂浮不动或轻微肢体活动的时间百分比，用来反映小鼠的无助程度。

SuperFst强迫游泳实验分析软件：http://www.softmaze.com/s02/product/2014/06/11/20137130.html

1.4.3 体质量：分别于造模前、造模后、**后，记录各组小鼠体质量情况，以反映造模后、**后小鼠生理情况。

1.4.4 血清5-HT测试：小鼠剪尾取血50 μL，室温静置2 h，使血液充分凝固，室温3 000 r/min离心15 min，取20 μL上清液，加入等体积0.9%氯化钠溶液稀释至40 μL，按照ELISA说明书进行操作，*后用酶标仪测定OD值，根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的回归方程。

1.4.5 OR 基因检测：采用实时荧光定量PCR（RTqPCR）检测小鼠OR 基因表达水平，先用TRIzol法提取小鼠嗅球区域组织总RNA。提取的RNA溶于DEPC处理水后经琼脂糖凝胶电泳及紫外-可见分光光度计测其OD260/280值检测RNA纯度和浓度。cDNA模板的合成则按照反转录实验手册使用FastQuant cDNA**链合成试剂盒合成cDNA。反应体系包括10 μL反应体系一：2 μL 5×gDNA Buffer、1 μg RNA、RNase-Free ddH2O补足到10 μL；10 μL反应体系二：2 μL 10×Fast RT Buffer、1 μL RT Enzyme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix和5 μL RNase-Free ddH2O。

先将体系一于42 ℃孵育3 min后立即放置在冰上，然后将反应体系二全部加入反应体系一中；*后将混合反应体系42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，并4 ℃保存。合成的cDNA置于-20 ℃保存备用。以上所有样品均设置3 个生物学重复。为了探索抑郁症与嗅觉反应之间的关系，研究测定了**后相同周龄各组小鼠的13 个OR 基因（MOR11、MOR1、MOR124、MOR16、MOR378、MOR544、MOR19、MOR744、MOR63、MOR148、MOR9、MOR151和MOR15）表达水平。用GAPDH作为内参基因。用做RT-qPCR的所有基因的引物见表1。每个PCR反应体系为20 μL，包括10 μLSupermix，1 μL正向引物（10 μmol/L），1 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL cDNA，7 μL**蒸馏水。采用的qPCR扩增程序为：预变性95 ℃ 3 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s和70 ℃ 10 s扩增40个循环。每个基因的相对表达水平采用Ct 值法的相对定量法计算。计算公式为2-ΔΔCt 来计算基因的相对表达量，其中：ΔΔCt =ΔCt 目的基因-ΔCt 正常组基因，ΔCt =Ct 目的基因-Ct 内参基因。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计量资料用 ±s 表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较时，方差齐性采用LSD法，方差不齐采用Games-Howell法，组内比较采用配对样本t 检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量变化 造模前，各组小鼠体质量差异无统计学意义（P ＞0.05）。正常组小鼠在正常饲养28 d后，随着年龄的增长，其体质量显著增加（P ＜0.05）。其余4 组小鼠经过28 d造模成功后体质量与各自造模前差异无统计学意义（P ＞0.05），但是都显著轻于相同周龄的正常组（P ＜0.05）。采用相应的芳香物质**28 d后，丁香组及莉组小鼠体质量与造模后比明显增加（P ＜0.05），且与正常组差异无统计学意义（P ＞0.05）。蒸馏水组和抑郁组小鼠体质量与**前相比，差异无统计学意义（P ＞0.05），且显著低于同周龄正常组（P ＜0.05）

2.2 悬尾不动时间百分比变化 造模前，各组小鼠悬尾不动时间百分比相近，差异无统计学意义（P ＞0.05）。造模后，丁香组、莉组、抑郁组和蒸馏水组小鼠悬尾不动时间百分比较造模前明显上升（P ＜0.05），显著高于正常组。正常组小鼠在正常饲养28 d后，其悬尾不动时间百分比差异无统计学意义（P ＞0.05）。采用相应的芳香物质**28 d后，丁香组小鼠悬尾不动时间百分比较造模后明显下降（P ＜0.05），与正常组比差异无统计学意义（P ＞0.05）。莉组、蒸馏水组和抑郁组小鼠悬尾不动时间百分比较造模后差异无统计学意义（P ＞0.05），但仍有显著高于正常组（P ＜0.05）。

2.3 强迫游泳不动时间百分比变化 造模前，各组小鼠强迫游泳不动时间百分比相近，差异无统计学意义（P ＞0.05）。正常组小鼠在正常饲养28 d后，其强迫游泳不动时间百分比差异无统计学意义（P ＞0.05）。造模后，丁香组、莉组、抑郁组和蒸馏水组小鼠强迫游泳不动时间百分比较造模前明显上升，且显著高于正常组（P ＜0.05）。采用相应的芳香物质**28 d后，丁香组小鼠强迫游泳不动时间百分比较**前显著下降（P ＜0.05），且与正常组比差异无统计学意义（P ＞0.05）。mo莉组、蒸馏水组和抑郁组小鼠强迫游泳不动时间百分比较**前差异无统计学意义（P ＞0.05），但仍高于正常组（P ＜0.05）

2.4 小鼠血清5-HT浓度变化 造模前，各组小鼠血清5-HT浓度相近，差异无统计学意义（P ＞0.05）。正常组小鼠在正常饲养28 d后，其血清5-HT浓度差异无统计学意义（P ＞0.05）。造模后，丁香组、莉组、抑郁组和蒸馏水组小鼠血清5-HT浓度较造模前明显下降，显著低于正常组（P ＜0.05）。采用相应的芳香物质**28 d后，丁香组小鼠血清5-HT浓度较**前显著提高（P ＜0.05），且与正常组差异无统计学意义（P ＞0.05）。莉组、蒸馏水组和抑郁组小鼠血清5-HT浓度较造模后差异无统计学意义（P＞0.05），但仍显著低于正常组（P ＜0.05）

2.5 **后各组小鼠OR 基因表达水平比较 各组小鼠13个OR 基因检测结果显示，没有经过任何**的抑郁组小鼠中除MOR11 外，其余OR 基因表达水平均显著低于正常组（P ＜0.05）。丁香组、莉组和蒸馏水组小鼠OR 基因表达水平则根据基因和芳香化合物的不同，与正常组差异不一样。丁香组小鼠中MOR11、MOR124、MOR16、MOR378、MOR15、MOR744、MOR1 和MOR63 的基因表达水平显著高于正常组（P ＜0.05），MOR544、MOR19 和MOR151 的基因表达水平则与正常组差异无统计学意义（P ＞0.05）；与蒸馏水组比，丁香组小鼠除MOR151 和MOR1 的基因表达水平差异无统计学意义（P ＞0.05），其余OR 基因均显著升高。莉组小鼠MOR744 和MOR1 基因表达水平显著高于正常组，MOR11、MOR151、MOR63 与正常组差异无统计学意义（P ＞0.05），其余基因表达水平均显著低于正常组（P ＜0.05）。莉组小鼠MOR11、MOR124、MOR19 和MOR378 基因表达水平与抑郁组比差异无统计学意义（P ＞0.05）。莉组与蒸馏水组小鼠MOR15、MOR544、MOR744、MOR151、MOR1 基因表达水平差异无统计学意义（P ＞0.05）。蒸馏水组小鼠MOR11、MOR744、MOR1、MOR63 基因表达水平显著高于正常组，MOR124、MOR16、MOR378、MOR151与正常组比差异无统计学意义（P ＞0.05），MOR15、MOR19、MOR544 基因表达水平显著低于正常组，但仍显著性高于抑郁组（P ＜0.05）。见图1-2。另外，在所有检测的OR 基因中，只有MOR148 和MOR9 在经过丁香精油和莉精油雾化**后基因表达水平仍显著低于正常组。

3 讨论

抑郁症目前的**手段有抗抑郁****、心理**、物理**、中医**等方法，其中，抗抑郁**是主要的**手段，但也存在不足之处，如**反应较严重，易复发，服从性差，靶点单一等。中医是我国医疗的特色，对抑郁症的**也有独特之处，例如针灸、药膳、芳香疗法等。相比针灸、药膳，芳香物质疗法更方便、舒适、易于接受。芳香疗法可通过口服、肠道、吸入及局部皮肤等给药途径对机体产生作用，口服的方式吸收较快，但从**角度看，吸入和肌肤给药较为**，而且方便控制剂量。芳香疗法**抑郁症需要嗅觉的参与，因此，OR 基因的表达水平高低对芳香**抑郁症效果的评判具有重要的指标性意义。

嗅觉是动物感觉中*重要的本能感觉之一，由上千个基因超家族控制，特异性受体决定OR神经元所识别的气味分子嗅觉信息除了传导至大脑皮层产生嗅觉外，也可传至边缘系统，参与行为、记忆、情绪等活动，从而影响**及***功能。由于抑郁症与嗅觉的关系密切，嗅球切除动物模型被广泛运用于抗抑郁**的筛选。芳香气味分子被吸入鼻腔，被鼻黏膜中的OR识别和结合，产生动作电位，嗅觉信号传导至大脑皮层的嗅觉区，促进神经化学物质的释放，然后经由大脑**神经发出指令，去调控和平衡植物神经系统，从而产生镇定、放松、愉悦或兴奋的效果。通过呼吸，植物的香味分子也可以进入肺部，在肺部进**体交换，再进入血液循环系统，达到相应的疗效。因此芳香物质**法的效果与动物嗅觉之间具有很重要的关系。为了研究芳香化合物对抑郁症的**效果，建立小鼠抑郁模型至关重要。建立动物抑郁模型的方法很多，如CUMS+孤养，行为绝望、社会应激、电诱导、利血平拮抗以及糖皮质**受体基因突变等，其中CUMS+孤养的小鼠抑郁症建模方式不仅成功率高，模型可靠，而且能更好地模拟抑郁症病征，可以用来探究病因、病理及测试**情况。这种建模方式30 年前由KATZ提出，迄今为止，已在许多研究中被成功运用。采用CUMS+孤养方式成功造模后，与正常小鼠相比，患有抑郁症的小鼠多个生理指标会产生显著性变化，如体质量下降、摄食量减少、敞箱实验中水平运动及垂直运动得分下降，糖水偏爱百分比下降等，还有悬尾不动时间百分比及强迫游泳不动时间百分比显著上升。

本研究采用CUMS+孤养方式造模后，与正常小鼠相比，患有抑郁症的小鼠出现体质量下降，悬尾不动时间和强迫游泳时间延长，血清5-HT浓度降低等显著性生理变化；与造模前相比除体质量无明显变化外，其余指标均呈现相同趋势的变化。这与以前的许多研究成果一致，表明抑郁症模型造模成功。如杨春蕊采用CMUS+孤养的方法成功建立小鼠抑郁模型后，发现抑郁小鼠与造模前体质量差异不大，但与相同周龄正常小鼠相比，体质量有明显下降；悬尾不动时间和强迫游泳不动时间也显著延长。王艳梅也同样通过CMUS+孤养的方式成功建立小鼠抑郁模型后，发现与造模前相比，悬尾不动时间和强迫游泳不动时间显著增加，血清5-HT浓度明显下降。另外，有研究表明，选择6～8周龄小鼠成功造模后，抑郁小鼠体质量不仅与正常小鼠相比显著下降，而且与造模前体质量比也有显著下降。而本研究结果表明，小鼠抑郁后的体质量只显著轻于相同周龄正常小鼠，与其造模前相比，却无明显变化。这可能与选取的小鼠周龄有关，我们选取的小鼠为成年期（8～12 周）小鼠。有研究表明，刺激年幼的动物，会增加对抑郁的易感性。因此，选择成年期小鼠可以保证小鼠各项指标测试结果更加稳定.

芳香疗法具有代谢快、高渗透性、不滞留、**反应小等优势，容易透过血脑屏障，达到**效果，而且效果与西药**相当。近年来，国内外学者对芳香物质**抑郁症进行了大量的研究。早在2001年就有研究指出薰衣草香味可以缓解紧张情绪。2008 年，KIECOLT-GLASER等研究发现柑橘香味可以改善抑郁症。2009 年，刘瑶等发现芳香疗法与抗抑郁****疗效相当，且芳香疗法对消化道的**反应较抗抑郁**低。徐金勇等指出丁香吸入可缓解抑郁症小鼠的抑郁行为。2010 年，牛利华等指出薰衣草吸入能有效改善抑郁症小鼠的抑郁行为，并对其作用机制进行了初步探讨，BAGATTA等研究发现佛手柑精油可减轻焦虑症状并能调节情绪。2013年，王艳梅研究表明，香草醛可改善小鼠抑郁行为。张乃舒等指出芳香疗法可作为辅助疗法用来缓解产后抑郁症患者。魏永鸽等通过按摩、涂抹、吸入等方式使用精油能有效地改善亚健康状态。2017年LEE等指出芳香疗法可以缓解抑郁症状，提高睡眠质量，却不影响生理参数如**因子等。国内*新临床研究表明芳香精油经络推拿对抑郁症低动力症状有较好的临床疗效。

由此可见，利用芳香物质**抑郁症一种行之有效的方法。本研究中抑郁症小鼠在接受相应**后，通过测定小鼠的各项生理指标发现丁香精油雾化**法对抑郁症具有确切疗效，而莉精油雾化**法对抑郁症疗效较差。丁香精油雾化**可以缓解甚至**小鼠抑郁症已在以前的研究中得到了验证。有研究发现莉花香可以改善人的情绪，且饮用莉花茶可以起到抗抑郁的功效，这与我们的研究结果不一致，可能是由于采用的**方法不同或者是**的对象不同所导致。