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神经功能行为、放射学及病理结果的变化

日期:2019-09-17 12:29
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摘要:
一种慢性颈段脊髓压迫的大鼠模型的建立:神经功能行为、放射学及病理结果的变化
摘要:
颈髓病是由于脊柱退行变造成的脊髓的慢性部分受压所致。不管怎么样,慢性颈髓受压的确切机制还没有完全清楚。本研究的目的旨在建立一种有效的新的没有锥板切除的慢性脊髓压迫动物模型,来复制临床过程。系在一块塑料板上的聚乙烯线,用来绑在一个月大的大鼠的C4椎体上,缠绕三圈。术后,随着椎管和椎体的生长,聚乙烯线逐渐长入椎管背侧的骨头里,而产生脊髓渐进性的压缩。结果表明:在形成颈椎管狭窄9个月后,颈椎管狭窄模型的大鼠出现运动障碍和感觉障碍;然而,直到6个月才出现临床症状。12个月后,70%的颈椎管狭窄模型大鼠出现了脊髓内高信号。在病理切片,在形成颈椎管狭窄12个月后脊髓整个周围压缩。运动神经元数目减少,白质显示华勒氏变性。本模型也许能够复制临床慢性颈髓压迫的特征性临床特点,包括在潜伏期和隐形神经云减少后出现,进行性运动和感觉功能,以及代表了人类慢性颈髓压迫。

关键字:动物研究;行为评估;核磁共振;神经元死亡;脊髓损伤。

引言:
一般认为,慢性压迫脊髓病的病因与颈椎的病理特点相关,例如椎关节硬化,韧带骨化,椎管狭窄,以及椎间盘突出,或许由机械性压迫和血管病变两种因素引起所致。慢性压迫性脊髓病隐匿性地和进展性地损伤运动和感觉动能。很多病人数年没有临床症状,尽管这个时期内存在脊髓压迫和缺陷,一旦本**出现临床症状,神功功能障碍进行性加重,很少有逆转。随机选择的有症状队列的颈部核磁共振检查的一项研究表明大于64岁的受试者26%出现脊髓损伤,45-64岁受试者16%出现脊髓损伤。临床上,即使那些由神经影像学确诊的严重,检查经常显示不可预料的非重要性神经功能发现,和手术减压后的可观的神经恢复也许是可以预料到。因此,慢性脊髓压迫的一个急性脊髓损伤没有的特点就是脊髓的可塑性。到目前为止,临床上慢性颈髓术后效果在持续提高。不管怎样,仍有一些不满意的结果,即使是充分的减压手术。这就意味着,颈髓严重受损以至于在病程中恢复性小。损伤过程的确切病理机制仍然不是完全清楚,但是灌注不足和血管栓塞已经被证实是可能因素。尸体标本的脊髓病理检查发现,运动神经元减少以及灰质中的血管退行性变,以及脱髓鞘和轴索水肿。一个次病理情况的合适的模型应该展示压缩引入后的隐匿性神经功能障碍的隐匿期,随后进行性的功能障碍时期。进一步,做一个没有脊髓损伤的模型具有重要意义。此研究的旨在产生一种新的脊髓慢性压迫损伤模型,来满足这些临床条件,运用MRI和病理学检查来评估运动感觉功能。
材料:
动物
本实验在当地动物伦理委员会和本大学动物实验监督条例以及日本政府动物保护和管理法规与日本政府饲养动物通知的监督下进行。实验用27只雄性SD大鼠,3周大,平均体重51g。在温度22度,湿度55%实验室条件下饲养动物,同时能够自由获取饮水和食物。
颈椎管狭窄模型的制作
术前,动物在笼子中饲养一周,以适应环境。用****钠腹腔内注射麻醉(35mg/kg)。每只大鼠均俯卧位置于加热板上,手术在严格无菌条件下进行。体温保持在37°C,血压用无创血压监护仪监护,以保持术中平稳的生理状态。以C4棘突为中心,做一纵行皮肤切口,从锥板上钝性两侧椎旁肌。暴露双侧锥板,在显微镜下分离出C4、C5根部,并切除。然后,切除C4棘突,实行椎板去皮质术。C4左侧从侧面牵拉到一侧,聚乙烯通过C4椎体的腹侧,固定在一块1*2*0.5mm 大小的抵在C4椎体腹侧上的塑料片上,然后缠绕三圈固定。在本模型中,随着椎管和椎体的生长,聚乙烯线逐渐长入椎管的椎板里。因此形成渐进性的脊髓压迫。对照组只进行C4C5椎板的暴露,不进行捆扎。对照组10只大鼠,控制组10只大鼠,术后继续在以上描述的实验室条件饲养12个月。
神经功能评价
BBB评分。术后1,3,6,9,12个月每组用BBB评分评价神经运动功能。BBB评分主要用于实验性脊髓损伤后运动功能评价。简言之,BBB是21分序列,从0(没有后肢移动)到21分(持续协调的后肢运动)。0-7分为恢复的早期阶段,8-13分描述恢复期的中间阶段,14-21代表恢复的晚期阶段,用阶段性的脚趾头的清理,主要爪子为止,步态稳定性,指甲位置。两名检查者观察和评价每只大鼠4-min的运动。神经检查运用双盲技术。
核磁共振研究
MRI研究:核磁共振研究在术后3、6、9、12个月,用0.4T永磁仪。检查系列包括T1(350/25),T2O(5000/119),视野150mm,5mm厚度层面,256*256矩阵,以及4个激发点。扫描时间为5-6分钟。所有的动物在俯卧位扫描,颈段被放置在线圈的中央,位于静态磁场的等中心点。
脊髓的横断面积和压迫率,由运用MR图像数字转化仪,T1加权像矢状面通过*大压迫水平的区域获得。压迫率由前后直径脊髓的横断面的直径。将实验组和对照组的脊髓的压迫率和横断面积进行比较。
髓内高信号区域的有无用T2加权性像来检查。定量测量由ROI技术来测量颈段脊髓的高信号。所有序列的SDNRS被用来评价颈段脊髓来评价脊髓和其椎管内的周围组织。SDNRS由单独测量脊髓的信号强度(平均ROI)评价和颈部外阶段分码方向,包括重影伪影。两种获得的变量的区别在于在同一图像中。
组织病理学的检查:
在MR图像研究后,所有大鼠被处死用来做组织病理学检查。所有的动物用4%的甲醛主动脉内灌注固定。颈脊柱被取下,并固定在相同溶液中1周。标本用0.5m乙二胺酸脱钙,和用石标准程序蜡包埋。光学显微镜下标本从C2到C7,头段到尾端横断面切除,共600片,每片5μm厚。每个的第10片尼氏染色,在每个染色片段显微拍照包含整个腹角。
运动神经元,被识别出有大核仁,以及发育好的致密染色的尼氏体。核仁,正常中央,包含与周围的细胞核正常分界。为了获得,。为了获得**的神经元计数,没有遗漏或重复,我们选择切片5μm厚度,留下5微米的距离,基于以下立体考虑:典型的大核仁直径大约5μm,而且这个直径是一致;选择切片的厚度和间隔厚度5μm球形核仁,这意味着每个切片将包含核仁的完整轮廓,他们的中央在在切片之外2.5μm之内。因此计数运动神经元的核仁,这些核仁出现在5μm厚度的视野中,这些核仁中央局限在5μm之内在每个切片中央的每边上,因此在切片间留5μm的间隔意味着立体计数能够避免运动神经元数目的遗漏或者重复。
统计分析:
数据统计:数据用均数+标准误表达。BBB评分,*大跑步机速度,感觉评价,MR图像研究的统计数据,运动神经元的数目运用非参数比较(Wilcoxon’s rank sum test),用spss11。p<0.05.
结果:术后,动物均体健,无任何感染。对照组和实验组术后12个月的生存率分别在76.9%和71.4%。它们的体重增长快速,从手术时的51+-1.1克,三个月后到481.7 – 14.7 g (control rats), or to465.0 – 19.8 g (CCS model rat)。随后,两组体重均增加,12个月后,对照组和实验组体重分别增加至706.7 – 43.2 g and 679.1 – 43.9 g。两组生长无显著差异。
神经功能结果:
在术后3,6,9,12个月时,检测神经功能。在3个月和6个月时,没有大鼠出现脊髓病症状,BBB评分和*大跑步机速度类似于对照组。10只实验组的大鼠中的2只出现了BBB评分和*大跑步机速度下降,术后12个月,所有实验组的动物均出现了脊髓病症状。术后12个月实验组BBB评分实验组(17.3 –+ 1.6)低于对照组的(20.8 +– 0.4),实验组的*大跑步机速度(21.7 – +4.5m/min),低于对照组的(33.3 –+3.5m/min)。在von frey 纤维测试中,实验组的大鼠有着和对照组大鼠类似的过程,一直到术后6个月。3只出现了前肢和后肢的轻微的感觉麻木。随后,12个月后,所有的实验组模型,前肢的反应频率下降了(26.0 –+12.6%),后肢的反应频率下降了(21.0 –+ 23.8%)。
核磁共振:
核磁共振检查在颈椎模型后3/6/12个月时进行。在MR图像上,从6个月开始,CCS模型动物的脊髓逐渐变平,一直恶化至12个月时。从脊髓矢状位T1像获得的脊髓横截面积减少,运动神经元数目的减少。(表1和图片5)。在所有的CCS模型大鼠白质显示髓鞘破坏,和海绵状轴索退变。病理改变发生主要在压缩区域下方。
组织病理结果:一种慢性颈段脊髓压迫的大鼠模型的建立:神经功能行为、放射学及病理结果的变化
讨论:
颈髓病是压迫性脊髓病*严重的后果,例如椎关节强硬,韧带骨化,椎管狭窄,和椎间盘突出症,但是他的病理细节没有被理解。一个原因就是实验动物的满意的慢性颈脊髓受压模型没有建立起来。目前为止,大量的方法运用于产生脊髓压迫损伤;不管怎么样,大多数有有用的模型仅仅适用于急性或亚急性压迫损伤,运用锥板切除形成脊髓损伤,因此硬脊膜组织,血管损伤和**组织形成。没有合适动物模型用来分析慢性颈髓压迫的效应。其他模型,包括肿瘤细胞的移植,螺钉的渐进性拧紧,扩张性薄片的移植,脊柱韧带骨化基因大鼠。这些模型有一些缺点,例如肿瘤模型生长过快,硬膜外组织损伤在直接薄片或者螺钉移植、基因敲出小鼠压迫点缺乏选择性,可能发生在C1-C2以外的椎体。在我们模型,聚乙烯线利用椎管本身的生长,深陷在扩大的椎管中,这将渐进性脊髓压迫。产生颈髓压迫,而没有在椎管上实施手术,因此硬膜外组织没有损伤,锥板切除的**组织没有发生。大鼠和人类的骨成熟分别是大约3-4个月大,和13-16岁大。大鼠和人类的脊髓生长完成大约在出生后3个月和18岁因此,3周大小的大鼠和12个月相对应与人类的青少年和老年。一些研究已经发现了人类的压迫性脊髓的形态学在CT或者MRI影像与临床症状的关系。据报道,如果通过CT影像学和核磁共振成像确诊时脊髓横截面积少于55-75%时,脊髓就不能耐受。另外,人类颈髓压迫的典型特点是,在引起脊髓压迫后,临床症状出现的的隐匿性和延迟性。在本项研究中,颈髓压迫没有导致脊髓的急性的持续的神经功能障碍。所有的动物在术后都恢复了正常的神经功能状态。在核磁共振图像上,颈椎管狭窄的脊髓逐渐扁平,从术后6个月开始。

结论:本研究建立了一种新的有效的,没有直接损伤大鼠脊髓的慢性颈髓压迫模型。在本实验中,用聚乙烯线捆扎C4椎体的大鼠在9个月后出现了运动障碍及感觉障碍;但是,直到6个月时才出现临床症状。这种隐匿性和延迟的症状正是脊髓慢性压迫的*典型的特点之一。因此,本模型或许复制了人类慢性颈部脊髓压迫的过程。
 

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